Bioengineered viral nanorings for the insertion into bio-hybrid systems

Filtereinheiten mit nanoskopischer Porengröße werden zunehmend für medizinische Anwendungen und analytische Verfahren eingesetzt. DNA-Moleküle lassen sich bereits durch Nanoporen sequenzieren, und auch für schnelle und exakte Analysen niedermolekularer Substanzen bergen sie ein hohes Potential. Besonders schwierig ist es allerdings, nanoporöse Membranen mit Millionen von identischen Poren herzustellen. Hybridmembranen könnten hier einen Ausweg bieten, indem sich selbst organisierende biologische Komponenten als "Porenadapter" in poröse anorganische Festkörpermembranen (solid-state membranes, SSMs) integriert werden. Die biologischen Einheiten definieren dann Durchmesser und physikochemische Eigenschaften der effektiven Poren und damit die Selektivität der Filtermembran. Im Rahmen dieses Promotionsprojekts wurde ein neuer stabiler, aber zugleich auch genetisch und chemisch leicht manipulierbarer Porenadapter aus Pflanzenvirusbausteinen entwickelt und für die Insertion in SSM-Poren erprobt und optimiert. Er ist sowohl an seinem äußeren Rand, als auch im Innenkanal spezifisch funktionalisierbar. Als Ausgangsmaterial diente das pflanzenpathogene Tabakmosaikvirus (TMV), ein Nukleoprotein-Röhrchen, das aus einem einzelsträngige (ss)RNA-Molekül und ca. 2130 Hüllprotein-(coat protein, CP)- Untereinheiten besteht. Sowohl die Länge der Partikel, gesteuert über die RNA- Länge, als auch die Protein-Sequenz des CP sind leicht manipulierbar, weshalb TMV zu einem beliebten multifunktionalen Nanobaustein in Hybridmaterialien avanciert ist. Der neuartige Porenadapter aus TMV-Komponenten wurde speziell an die Insertion in eine SSM mit konisch geformten Poren angepasst, wie sie im Labor von Projektpartnern in Ulm hergestellt wird. Aus einem kurzen RNA-Konstrukt, das über In-vitro-Transkription präpariert wurde, und ca. 68 CPs organisiert sich dieser Adapter selbst als eine vierwindige 10 nm lange Nukleoprotein-Helix, die angesichts ihrer lochscheibenähnlichen Form im Folgenden auch „Disk“ genannt wird. Da die „Disks“ in den SSM-Poren unter leicht alkalischen Bedingungen irreversibel fixierbar sein sollen, wurde ihre Struktur im Bereich von pH 7.2 bis 9.0 untersucht und erwies sich als stabil. Damit waren sie den natürlich vorkommenden ringförmigen RNA- freien TMV-CP-Aggregaten klar überlegen, die innerhalb dieses pH-Regimes oligomerisierten und im alkalischen Milieu zerfielen. Auf Isothiocyanat- funktionalisierten Substraten konnten die RNA-haltigen „Disks“ kovalent immobilisiert werden, sodass alle Voraussetzungen für ihre Integration in SSM-Poren bestanden. Bereits in ersten Kombinationsversuchen ließen sich die „Disks“ mit guter Effizienz in SSM-Porenkanäle inserieren, waren aber in den Poren oft nicht richtig orientiert. Deshalb wurde im zweiten Teil des Projekts ein verfeinertes Adapter-Konstrukt mit einer stark polaren Achse konzipiert, das sich, ausgerichtet in einem elektrischen Feld, in die SSM-Poren einfädeln lässt. Es besteht aus einer Nukleoprotein-„Disk“ mit herausragender freier doppelstängiger (ds)RNA, wodurch es über eine wesentlich höhere negative Ladung als die Porenadapter der ersten Generation verfügt. Dank der spezifischen Interaktion der CPs mit ssRNA konnte ein RNA-Konstrukt, das partiell einzel- und partiell doppelsträngig ist, als Grundgerüst für solche „Disks an der Leine" dienen. In gelelektrophoretischen Analysen zeigten die Produkte tatsächlich eine höhere Mobilität als herkömmliche „Disks“. Ziel ist schließlich eine robuste Hybridmembran, in der biologische Porenadapter irreversibel in die SSM-Kanäle implantiert und Leckströme gering sind. Dies ließe sich durch das Abscheiden von anorganischem Material zwischen SSM-Poreninnenwand und „Disk“-Rand erreichen, wenn die Lücke zwischen beiden Komponenten an der Grenzfläche ortsselektiv versiegelt werden könnte. Dafür sind im letzten Teil der Arbeit „Disks“ mit spezifisch mineralisierbarer Außenfläche entstanden, welche ihre Silikat-Ummantelung aus löslichen anorganischen Vorstufen induzieren. Verschiedene mineralisationsvermittelnde Peptide wurden chemisch an TMV-Partikel gebunden und die SiO2-Abscheidungseffizienzen vergleichend untersucht. Besonders vielversprechend war ein Peptid mit alternierendem Lysin-Aspartat-Motiv, (KD)10C, das auf Grundlage von Literaturdaten entworfen wurde. Es lieferte tatsächlich auch nach Konjugation an „Disk“-Außenflächen ausgezeichnete Ergebnisse: Die so mit Peptiden funktionalisierten „Disks“ bewirkten eine ringförmige Abscheidung von SiO2, was bei unmodifizierten „Disks“ nicht beobachtet wurde. Die neuartigen RNA-stabilisierten und leicht funktionalisierbaren „Disks“ aus TMV- Derivaten sind somit aussichtsreiche biologische Porenadapter zur lipidfreien Insertion in Festkörper-Template. Dank der großen Adaptierbarkeit dieser Nanobausteine könnten davon vielfältige Anwendungen profitieren

Peptide-equipped tobacco mosaic virus templates for selective and controllable biomineral deposition

The coating of regular-shaped, readily available nanorod biotemplates with inorganic compounds has attracted increasing interest during recent years. The goal is an effective, bioinspired fabrication of fiber-reinforced composites and robust, miniaturized technical devices. Major challenges in the synthesis of applicable mineralized nanorods lie in selectivity and adjustability of the inorganic material deposited on the biological, rod-shaped backbones, with respect to thickness and surface profile of the resulting coating, as well as the avoidance of aggregation into extended superstructures. Nanotubular tobacco mosaic virus (TMV) templates have proved particularly suitable towards this goal: Their multivalent protein coating can be modified by high-surface-density conjugation of peptides, inducing and governing silica deposition from precursor solutions in vitro. In this study, TMV has been equipped with mineralization-directing peptides designed to yield silica coatings in a reliable and predictable manner via precipitation from tetraethoxysilane (TEOS) precursors. Three peptide groups were compared regarding their influence on silica polymerization: (i) two peptide variants with alternating basic and acidic residues, i.e. lysine–aspartic acid (KD)$_{χ}$ motifs expected to act as charge-relay systems promoting TEOS hydrolysis and silica polymerization; (ii) a tetrahistidine-exposing polypeptide (CA$_{4}$H$_{4}$) known to induce silicification due to the positive charge of its clustered imidazole side chains; and (iii) two peptides with high ZnO binding affinity. Differential effects on the mineralization of the TMV surface were demonstrated, where a (KD)$_{χ}$ charge-relay peptide (designed in this study) led to the most reproducible and selective silica deposition. A homogenous coating of the biotemplate and tight control of shell thickness were achieved

Bioinspired Silica Mineralization on Viral Templates

Plant virus capsids are attractive entities for nanotechnological applications because of their variation in shape and natural assembly ability. This chapter describes the production and modification of three differently shaped plant virus capsids for silica mineralization purposes. The chosen plant viruses exhibit either an icosahedral (cowpea mosaic virus, CPMV), or a flexuous rod-like structure (potato virus X, PVX), or a rigid rod-like shape (tobacco mosaic virus, TMV), and are well-known and frequently used plant viruses for biotechnological applications. We describe the production (including genetic or chemical modification) and purification of the plant viruses or of empty virus-like particles in the case of CPMV, as well as the characterization of these harvested templates. The mineralization procedures and differences in the protocols specific to the distinct viruses are described, and the analyses of the mineralization results are explained

Electrochemically-Driven Insertion of Biological Nanodiscs into Solid State Membrane Pores as a Basis for "Pore-In-Pore" Membranes

Nanoporous membranes are of increasing interest for many applications, such as molecular filters, biosensors, nanofluidic logic and energy conversion devices. To meet high-quality standards, e.g., in molecular separation processes, membranes with well-defined pores in terms of pore diameter and chemical properties are required. However, the preparation of membranes with narrow pore diameter distributions is still challenging. In the work presented here, we demonstrate a strategy, a “pore-in-pore” approach, where the conical pores of a solid state membrane produced by a multi-step top-down lithography procedure are used as a template to insert precisely-formed biomolecular nanodiscs with exactly defined inner and outer diameters. These nanodiscs, which are the building blocks of tobacco mosaic virus-deduced particles, consist of coat proteins, which self-assemble under defined experimental conditions with a stabilizing short RNA. We demonstrate that the insertion of the nanodiscs can be driven either by diffusion due to a concentration gradient or by applying an electric field along the cross-section of the solid state membrane. It is found that the electrophoresis-driven insertion is significantly more effective than the insertion via the concentration gradien